2022年7月22日，国际期刊《Nature communications》在线刊登了浙江大学基础医学院/浙江省良渚实验室郭国骥团队的学术论文“Construction of the axolotl cell landscape using combinatorial hybridization sequencing at single cell resolution”。该研究利用自主构建的组合杂交高通量单细胞测序平台，绘制了再生医学领域模式动物墨西哥钝口螈正常与变态发育的单细胞转录组图谱，系统性的比较了蝾螈变态发育前后多组织细胞类型基因表达模式，揭示了变态发育前后组织内细胞类型扰动变化的模式，并构建了影响变态发育过程中基因表达的调控网络模型。

墨西哥钝口螈是一种比较成熟的模式生物，已被用于发育生物学研究中。由于这种生物具有强大的组织再生能力，许多研究者都在探究墨西哥钝口螈组织再生能力的分子机制。有趣的是，终生维持幼态的蝾螈需要激素或环境诱导才能进入变态发育过程，经历从水生环境到陆地生存环境的变化，这与其他两栖动物不同。在这一过程中，蝾螈内部的很多组织器官会经历重塑和功能变化，其组织的再生能力也会减弱。绘制蝾螈正常与变态发育的单细胞图谱，能为解析其再生与变态发育过程的分子机制提供帮助。

在此项研究中，研究团队构建了基于组合杂交标记原理的高通量单细胞测序方法（Combinatorial Hybridization Sequencing，CH-seq）, 该方法将固定单细胞悬液加入含有特异DNA标记序列的96孔板中分散，并在细胞原位进行逆转录反应。细胞混合后被重新分散到多个96孔板并杂交上带另一段标记的DNA序列，并完成双链DNA合成，随后将所有细胞回收裂解，进行文库构建与高通量测序。与已经发表的细胞内原位标记测序方法相比，组合杂交测序不依赖T4连接酶进行多段DNA 标记连接，证实了依靠单纯DNA杂交即可进行稳定的多段DNA标记。该方法进一步节省了实验成本并能灵活控制实验通量，可以一次进行数十万到百万单细胞转录组的文库构建。利用该技术，研究团队绘制了成体幼态维持蝾螈18个组织与成体诱导变态发育蝾螈16个组织一共超过百万细胞的转录组图谱。解析了变态发育前后的基因表达调控模式。此外，研究团队也对四肢完全发育的窗口期（受精卵发育第30到70天）5个时间节点的幼年蝾螈进行了个体全细胞转录组测序，揭示了肢体发育过程与断肢再生过程的基因表达相关性，鉴定了随发育时间变化的关键基因及其功能。

在对幼态维持和变态发育蝾螈细胞图谱的比较分析中，研究团队鉴定了不同角蛋白和粘蛋白基因在重塑较明显的皮肤、尾巴、肢体中的变化表达模式。这些基因的表达上调与蝾螈进化到陆地生活环境的表型变化直接相关。变态发育蝾螈胃肠道中纤维原蛋白和内源性前列腺素的增加与保护作用也提示了消化代谢系统在组织重塑过程中的稳态调节功能。在幼年蝾螈肢体发育过程中，本研究发现了一些在幼态维持动物（如裸鼹鼠）发育阶段中保守表达的基因，如A2m与Hapln3，通过发挥透明质酸调节等功能，影响蝾螈的再生能力与寿命。此外，研究团队也发现蝾螈变态发育过程中运动系统内肌肉骨骼谱系与呼吸系统内上皮谱系的分化增强。对变态发育与物种水生-陆地进化的比较研究提供了数据资源。

浙江大学基础医学院2016级直博生叶昉（已毕业）、2022级博士生张国栋、鄂唯高等人为本文共同第一作者。浙江大学基础医学院郭国骥教授、韩晓平教授、广东省人民医院费继峰教授为本文的通讯作者。研究获得了国家重点研发计划，国家自然科学基金、浙江省自然科学基金的支持。